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Mikroskopie und Zytometrie




Kurzbeschreibung

An der Universitätsmedizin Greifswald wurde zwischen 2010 und 2014 im ZIK HIKE eine umfangreiche Technologiestrecke zu Untersuchungen von Blutzellen etabliert.

Die Einheit bietet zunächst mikroskopische Untersuchungen an Zellen mittels hochleistungs-Fluoreszenzmikroskopen und einem Laser-Scanning Mikroskop (Leica SP5) an. Eine zweite Strecke ermöglicht Zellpopulationsuntersuchungen mittels Durchflusszytometrie (BD), bildgebender Durchflusszytometrie (Amnis Image Stream) und Zellsortierung (FACS ARIA III).

Am FACS ARIA III selektierte Zellen können in Mikroreaktionsgefäßen, Mikrotiterplatten oder auch direkt in gerätespezifischen Chips mit mikrofluiden Kanälen (Fluidigm) aufgefangen werden. Mittels dieser Chips können molekularbiologische Untersuchungen an zuvor  mittels FACS ARIA III selektierten Zellen mit automatisierten Systemen (Single Cell Autoprep system von Fluidigm) und high throughput Genexpressionsanalyse (BioMark System von Fluidigm) durchgeführt werden.

Laserscanning-Mikroskop Leica SP5

Das Mikroskop ist mit einer Reihe von Lasern zur Exitation von zahlreichen Fluorophoren ausgestattet. Es enthält neben einem Diodenlaser mit 405 nm Wellenlänge weitere Argon Laser mit den Wellenlängen 458 nm,476 nm, 488 nm, 496 nm und 514 nm sowie einen DPSS Laser mit 561 nm und einen HeNe Laser mit 633 nm Wellenlänge.

Das Mikroskop ist außerdem mit Hybriddetektoren als Zusatzmodul ausgerüstet um die Signalverarbeitung der oft schwachen Fluoreszenzsignale z.B. in bestimmten Biopsieproben deutlich zu verstärken. Die neuen Hybriddetektoren, weisen eine verbesserte “Signal-to-Noise” Ratio auf, so dass der Nachweis selbst von einzelnen Molekülen möglich wird.

Neben dem Leica Mikroskop stehen weiterhin ein aufrechtes (Nikon ECLIPSE 90 i) und ein invertes (Nikon ECLIPSE Ti) Fluoreszenz-Forschungsmikroskop mit digitaler Filmaufzeichnung für Zelluntersuchungen zur Verfügung.

Durchflusszytometrie

Für schnelle, analytische Routineanalysen steht im ZIK HIKE ein Durchflusszytometer BD LSR II bereit.

ImageStream-X

Die Immage Stream Technologie von Amnis kombiniert die quantitative Leistungsfähigkeit eines Durchflusszytometers mit der Bildanalyse (High Content Image Analysis). Das Gerät liefert gleichzeitig Information über die Morphologie der Zelle Lokalisation des Fluoreszenzsignals und der Populationsstatistik in einem weiten Anwendungsfeld.

Das Gerät ist eine Kombination von Durchflußzytometer und Fluoreszenzmikroskop und wird für die mikroskopische Bildanalyse von mehreren tausenden Zellen in Suspension eingesetzt. Dabei werden mittels einer empfindlichen Digitalkamera bis zu 12 Bilder von jeder einzelnen Zelle erstellt. Durch die Ausrüstung mit mehreren Lasern und entsprechenden Filtern ist es möglich bis zu 10 Fluoreszenzfarben gleichzeitig zu analysieren. Mit diesem Gerät kann u.a. die Lokalisation eines oder mehrerer Proteine in einer hohen Anzahl von Zellen automatisiert quantifiziert werden.

FACS Aria III

Mit Hilfe des Aria III ist es möglich u.a. Antigen-spezifische B-Lymphozyten zu sortieren. Um die Einsatzmöglichkeiten zu erweitern wurde ein Upgrade vorgenommen, das einen zusätzlichen UV-Laser und drei zusätzliche Fluoreszenzdetektoren umfasst. Somit können jetzt gleichzeitig 6 Parameter mit dem violet/UV-Laser gemessen werden. Die am FACS Aria III selektierten Zellen können für weitere genetische Untersuchungen auf Einzellzellebene mit Hilfe des Single Cell Autoprep Systems sowie des BioMark Systems genutzt werden.

Single Cell Auto Prep System

Durch das C1 Single-Cell Auto Prep System können die Genexpressionsanalysen auch in Einzelzellen durchgeführt werden. Die Genexpressionsanalysen in Einzelzellen ist bei der konventionellen Methodik wegen der geringen Menge und der Instabilität der RNA äußerst störanfällig. In dem C1 Single-Cell Auto Prep System erfolgt die Auflösung der Zellen, die Isolation der RNA und die Umschreibung in DNA in einer geschlossenen Umgebung und vollkommen automatisiert.

Aus B-Lymphozyten, die die zuvor mittels Fluorochrom-markiertem Antigen am FACS Aria III selektiert wurden, können nach automatischer Präparation der RNA und nachfolgender Umschreibung in DNA schließlich die Sequenzen der Bindungsregionen der betreffenden Antikörper gewonnen werden. Der Einbau der entsprechenden DNA-Sequenzen in spezielle Vektoren würde schließlich die Produktion rekombinanter IgG-Moleküle in Bakterien oder anderen Expressionssystemen (CHO Zellen) erlauben.

BioMark HD

Das BioMark HD von Fluidigm ist ein Real-Time PCR System für „high throughput“ PCR basierend auf einer Chip-Technologie mit mikrofluiden Kanälen und Reaktionskammern. Mit diesem Gerät können bis zu 96 cDNA Proben mit bis zu 96 Primer Paaren automatisch analysiert werden und über Nacht damit 9216 PCR Reaktionen liefern.

 

 


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