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Forschung



 

  • Charakterisierung der Expression, Regulation und Funktion intestinaler Transportproteine und Metabolisierungsenzyme. In diesem Teilbereich wird die Expression aller bislang als klinisch bedeutsam identifizierten Transportproteine entlang des gesamten menschlichen Darms auf mRNA- und Proteinebene charakterisiert. Die Expressionsdaten  sollen in Kombination mit funktionellen Daten aus geeigneten in vitro-Modellen (z.B. Caco-2-Zellen) und früheren klinischen Studien unter Nutzung innovativer Prädiktionsalgorithmen (z.B. SimCyp©) die Arzneimittelabsorption aus dem menschlichen Darm vorhersagbar machen und unerwünschte Arzneimittelinteraktionen vermeiden helfen.
Abb. 1: Schematische Darstellung relevanter intestinaler Aufnahme- (blau) und Efflux-Transporter (rot) im menschlichen Darm
  • Charakterisierung der Affinität von Arzneistoffen zu Transportproteinen. In dieser Routineplattform nutzen wir zelluläre Transportermodelle (stabil transfizierte HEK293 oder MDCKII-Zellen) zur Bestimmung der Transporteraffinität von neuen und bereits etablierten Arzneistoffen. Hierbei stehen uns durch die im Rahmen des abgeschlossenen InnoProfile-Projektes „Wirkstofftransport-basierte Konzepte und Drug-Delivery-Technologien zur Optimierung der klinischen Anwendung von Arzneimitteln“ (2007-2012) zelluläre Modelle für nahezu alle klinisch bedeutsamen Aufnahme- und Effluxtransporter sowie funktionell relevanten genetischen Varianten zur Verfügung. Alle Modelle wurden hierbei nach einem internen Good Cell Culture Practice-Konzept entwickelt und funktionell validiert. Eine Übersicht über die vorhandenen Zelllinien und deren Validierung sind in Abbildung 1 und Tabelle 1 dargestellt.
Abb. 1: Beispiel der Validierung anhand stabil transfizierter HEK293-OATP2B1 Zellen mittels Immunhistochemie, Western-blot, mRNA-Quantifizierung und Funktionsassays mit zwei Substraten und zwei Inhibitoren

Tabelle 1: Im C_DAT entwickelte in-vitro-Zellmodelle für pharmakokinetisch relevante Transporter und deren funktionell relevante genetische Varianten, die in HEK293- sowie MDCKII-Zellen transfiziert worden sind.

 

HEK293-Zellen   MDCKII-Zellen  
(human embryonic kidney)   (Madin-Darby canine kidney)  
OATP1A2 *1 OATP1A2 *1
  *2   *2
  *3   *3
OATP1B1 *1a OATP1B1 *1a
  *1b   *1b
  *5   *5
  *15   *15
OATP1B3 WT OATP1B3 WT
  c.334T>G    
  c.699G>A    
  c.1564G>T    
  c.334T>G + c.699G>A    
OATP2B1 WT OATP2B1 WT
  c.601G>A   c.601G>A
  c.995G>A   c.995G>A
  c.1457C>T   c.1457C>T
OATP1C1      
OATP3A1   OA TP3A1  
OATP4A1   OATP4A1  
OATP4C1   OATP4C1  
OCT1      
OCT2      
OCT3      
OCTN2   OCTN2  
NTCP   NTCP  
ASBT   ASBT  
ABCB1   ABCB1  
ABCC2   ABCC2  
    ABCC3  
  • Charakterisierung der Expression von Transportproteinen in der humanen Plazenta. In diesem Projekt untersuchen wir gegenwärtig die mRNA- und Proteinexpression klinisch bedeutsamer Transportproteine an einer hauseigenen Gewebebank mit mehr als 600 Plazenten. Ziel der Arbeit ist es neben der reinen Expressionsanalyse, Aussagen über die etwaige physiologische und toxikologische Bedeutung von Transporterproteinen in der plazentaren Barriere vorherzusagen und den Einfluss genetischer Polymorphismen und von Schwangerschafts-assoziierten Erkrankungen (Gestosen) auf die Transporterexpression zu untersuchen. Die gewonnenen Expressionsdaten werden abschließend mit funktionellen Transportdaten aus dem Plazenta-Perfusionsmodell korreliert.
Abb. 1: Schematische des Synzytiotrophoblasten und der bisher beschriebenen Transporterexpression in der menschlichen Plazenta
  • Untersuchungen zum Einfluss von pharmazeutischen Hilfsstoffen auf die Funktion von Transportproteinen. Pharmazeutische Hilfsstoffe sind essentielle Bestandteile aller Arzneizubereitungen. Obwohl diese Substanzen per definitionem pharmakologisch inaktiv sein sollen, konnten wir in vorherigen Versuchen zeigen, dass sowohl Aufnahme- als auch Effluxtransporter signifikant in Ihrer Funktion beeinflusst werden (Hanke et al. 2010, Engel et al. 2012). Aktuelle Untersuchungen erweitern diese Untersuchungen im Bezug auf andere Transporter und Hilfsstoffe.
Abb. 1: Einfluss ausgesuchter Hilfsstoffe (SOL: Solutol© HS, CrEL: Cremophor© EL) auf die OATP-vermittelte zelluläre Aufnahme von Standardsubstraten (E3S: Estron-3-Sulftat, BSP: Bromosulphophthalein, E17ßG: Estradiol-17ß-Glukuronid)
  • Charakterisierung der Expression, Lokalisation, Regulation und Funktion pulmonaler Transportproteine. Zahlreiche Arzneistoffgruppen haben ihren Hauptwirkort im Lungengewebe bzw. in den Alveolarmakrophagen (z.B. Therapeutika gegen Asthma, COPD, Tuberkulose, Atemwegsinfektionen). Obwohl zahlreiche dieser Arzneistoffgruppen oral verabreicht werden oder einen intrazellulären Angriffspunkt besitzen, ist bislang nur wenig über die Transportmechanismen dieser Arzneistoffe zum Ort ihrer jeweiligen Wirkung bekannt. Bisherige Untersuchungen unserer Gruppe konnten Erkenntnisse einiger Transportportproteine für die Absorption und Verteilung von Antibiotika am Modell des Fohlens erbringen (Peters et al. 2011, 2012). Die gegenwärtige Forschung bezieht sich auf Untersuchungen zur Expression, Lokalisation und Funktion von Arzneistofftransportern im Fohlen und im Menschen. Eine Übersicht über die bisher bekannten Transporter in der Lunge bzw. in den Alveolarmakrophagen ist in Abbildung 1 dargestellt.
Abb. 1: Verteilung der in dem Lungenepithel und Alveolarmakrophagen von Menschen und Pferden (rot) vorkommenden Transporterproteine. *Für einige der humanen und für die beim Pferd nachgewiesenen Transporter konnte eine genaue Lokalisation der Transporter noch nicht endgültig bestätigt werden
  • Charakterisierung unerwünschter Arzneimittelwirkungen. Im Rahmen des Projektes Greifswald Approach to Individualized Medicine (GANI_MED) untersuchen wir genetische, epigenetische und metabolische Risikofaktoren, die das Auftreten einer schwerwiegenden unerwünschten Arzneimittelwirkung begünstigen. Dazu werden in Kooperation mit den Kliniken für Innere Medizin A und B alle Patienten erfasst, die aufgrund einer schwerwiegenden Nebenwirkung hospitalisiert werden. Ferner sollen die medizinische und wirtschaftliche Bedeutung von unerwünschten Arzneimittelwirkungen für Gesundheitsversorgungssysteme durch die Erfassung des regionalen Arzneimittelverbrauchs sowie die Schätzung der Inzidenz von unerwünschten Arzneimittelwirkungen evaluiert werden.
  • Entwicklung und Validierung von bioanalytischen Methode zur Quantifizierung von pharmakokinetisch nutzbaren Biomarkern. Ziel dieses Forschungsprojektes ist es, geeignete endogene Marker (Biomarker), die Aussagekraft zur Funktion von Metabolisierungsenzymen und Transportproteinen besitzen, zu identifizieren, entsprechende Quantifizierungsmethoden (primär LC-MS/MS) zu entwickeln und zu validieren.
  • Basischarakterisierung primärer Hepatozyten auf Transporterfunktion. Im Rahmen eines EU-finanzierten Verbundprojektes mit der Primacyt GmbH (Schwerin) wird die Transportaktivität in frisch isolierten und cryokonservierten primären Hepatozyten verschiedener Spezies (Mensch, Cynomolgus, Ratte, Hund) vergleichend charakterisiert. Ziel dieser Arbeiten ist es, ein sich dicht an der in vivo-Situation entsprechendes Zellmodell zum Transport von Arzneistoffen und/oder deren Lebertoxizität anbieten zu können.

Forschungstechniken

  • Molekular- und Zellbiologische Arbeiten. Zur Entwicklung und adäquaten Charakterisierung der genannten zellulären Transportermodelle stehen unserer Abteilung eine exzellente Forschungsinfrastruktur (S1, S2-Zelllabore, Isotopenlabor) sowie alle notwendigen molekular- und zellbiologischen Methoden zur Verfügung (Isolierung von RNA/DNA, PCR (real-time PCR, Mutagenese-PCR), Proteinanalytik mittels Western Blot und Immunofluoreszenz, Genexpressionsanalyse mittels real-time-PCR, Zellanalyse und –sortierung mittels FACS) (Ansprechpartner: Dr. Markus Keiser).
  • Quantitative Arzneistoff- und Proteinanalytik mittels LC-MS/MS in einem GLP-zertifizierten Labor. Hierbei stehen uns für eine hochqualitative Analytik 4 LC-MS/MS-Systeme, 2 GC-MS-Systeme sowie 5 HPLC-Geräte mit UV- / Fluoreszenzdetektion zur Verfügung (Ansprechpartner: Prof. Dr. Stefan Oswald).
  • Klinische Studien können in unserer abteilungseigenen Probandenstation durchgeführt werden. Hierbei stehen uns acht Probandenbetten zur Durchführung pharmakokinetischer Studien unter GCP-Bedingungen zur Verfügung. Die Probandenstation ist mit drei Prüfärzten und einer Stationsschwester ausgestattet (Ansprechpartner: Dr. Christiane Modess).

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